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母乳是嬰兒成長過程中重要的食品，國內(nèi)外的孕嬰保健機(jī)構(gòu)都建議初生嬰兒采用母乳喂養(yǎng)。母乳中含有的營養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、礦物質(zhì)等，易于嬰兒吸收。另外其所含有的抗感染因子，如IgA、乳鐵蛋白、溶菌酶及各種細(xì)胞成分，可增強(qiáng)嬰兒的免疫能力。因此，母乳中營養(yǎng)成分研究也成為營養(yǎng)學(xué)的一大領(lǐng)域。目前，已有對母乳中的維生素進(jìn)行研究并加以報(bào)道，但少有氨基酸的研究報(bào)道。本研究采用酸性條件下水解母乳中蛋白質(zhì)，柱前在線衍生與液相色譜紫外聯(lián)用分析母乳中氨基酸。

樣品前處理

17種氨基酸混標(biāo)溶液（除胱氨酸濃度為1.25μmol/ml，其它氨基酸濃度為2.5μmol/ml）

7M鹽酸：量取558ml鹽酸，用水稀釋至1000ml量瓶中，搖勻。

樣品由第三方醫(yī)療機(jī)構(gòu)收集不同哺乳期婦女的乳液樣品。樣品呈乳白色懸濁液（含有少量黃色液體油脂。低溫保存時(shí)，樣品取出后放置在40°C水浴中使固體油脂融化）。

水解：吸取1ml脫脂后的母乳樣品轉(zhuǎn)移至真空水解管中，加入0.6ml水解催化劑，在0.05MPa壓力下充氮保護(hù)3分鐘，再減壓脫氣3分鐘，密塞水解管并置于沸水浴上恒溫加熱8小時(shí)，冷卻至室溫，用40%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值2-3范圍內(nèi)，用0.1N鹽酸溶液稀釋并定容至10ml，搖勻并用微孔（0.22μm）濾膜過濾用于液相分析。

衍生程序

采用鄰苯二甲醛和氯甲酸芴甲酯在堿性條件下分別與一級氨基酸和二級氨基酸發(fā)生反應(yīng)，生成具有強(qiáng)烈紫外吸收的化合物。衍生過程在自動進(jìn)樣器中進(jìn)行。

衍生試劑：

硼酸緩沖液： 200mM 四硼酸鈉溶液（pH=10.2）

鄰苯二甲醛溶液（OPA）：50mg/ml(甲醇)

OPA/MPA溶液：0.8ml 硼酸緩沖液-0.2ml OPA溶液-20μl 3-巰基丙酸

氯甲酸芴甲酯（FMOC）溶液：2.5mg/ml（乙腈）

稀釋液：流動相A

衍生過程：200mM 硼酸緩沖液（5μL）+樣品（1μL）+OPA/MPA溶液（1μL）+FMOC溶液（1μL）+稀釋液（8μL）

儀器型號：

UltiMate3000:

LPG-3400，SN:8014896

WPS-3000TSL, SN:8014671

TCC-3000, SN:801179

DAD， SN:8037084

變色龍®色譜管理軟件（Chromeloeon®6.8 SR11）

色譜條件：

色譜柱 ： Hypersil GOLD C18色譜柱, 4.6×250mm, 5μm, PN:25005-254630

流動相 ：A: 20mM 乙酸鈉（加0.018%三乙胺，調(diào)節(jié)pH值至7.2，再加入0.3%四氫呋喃），B：100mM乙酸鈉（pH=7.2）-乙腈-甲醇（20:40:40）

梯度洗脫程序

進(jìn)樣量： 1μL

檢測器：檢測波長：380nm, 262nm, 3D掃描：190-400nm，采集頻率：5Hz

流速： 1000μL/min

柱溫：  35°C

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

01

水解條件優(yōu)化

在水解過程中，加熱溫度、水解持續(xù)時(shí)間和催化劑用量對水解有著重大影響。結(jié)合實(shí)際情況采用沸水浴加熱進(jìn)行水解，因此利用響應(yīng)面法對水解時(shí)間和催化劑用量的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果見表1和圖1。

表1 水解研究方案

圖1 氨基酸水解優(yōu)化結(jié)果

從圖1中可以看出，水解時(shí)間延長對氨基酸增加效果不明顯，水解催化劑用量對水解效率有顯著影響，隨著用量增大，氨基酸含量明顯增加，且達(dá)到大值，再增加用量時(shí)，氨基酸含量開始降低，可能原因是水解后的氨基酸在強(qiáng)酸性環(huán)境與高溫加熱條件下中發(fā)生降解從而引起含量降低。綜合實(shí)際操作考慮，故用0.6ml水解催化劑在沸水浴中水解8小時(shí)可獲得佳水解氨基酸含量。

02

 方法專屬性

取0.1N鹽酸做為空白試劑考察方法專屬性，結(jié)果見圖2和3。

03

線性范圍

取氨基酸混標(biāo)溶液用1%鹽酸（約0.1N）稀釋成濃度為0.025、0.05、0.125、0.25、0.50μmol/ml的溶液，按照前述條件測定其響應(yīng)值，并與濃度做線性回歸，結(jié)果見表4。

04

方法精密度

取對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5針，結(jié)果見圖4。

05

方法度

按前述方法平行測定母乳樣品與加標(biāo)樣品，計(jì)算其含量與加標(biāo)回收率。結(jié)果見圖5與表5。

表5加標(biāo)回收率（樣品編號：12-8，n=2）

結(jié)論

通過上述方法學(xué)考察結(jié)果分析，本方法具有線性范圍寬、專屬性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于母乳中測定氨基酸含量。