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如何用好HILIC,賽默飛幫您選擇色譜柱!
更新時間:2018-07-30   點擊次數(shù):5280次


對于做液相色譜分析的人來說,我們先接觸到的往往是對于弱極性或者中等極性化合物的分離。對于這類化合物的分析來說,常用的是C8或者C18的反相色譜柱,而且對于這類化合物的方法開發(fā)及條件優(yōu)化我們也都比較的熟悉。但是近些年來越來越多的人開始關(guān)注對極性化合物的分析,尤其是隨著對體內(nèi)代謝物的研究不斷發(fā)展,對我們分析極性代謝物提出了更多的挑戰(zhàn)。

 

其實現(xiàn)在我們很多人也會采用反相色譜柱來分析一些極性化合物,比如流動相中加入離子對試劑或者采用一些極性封端的反相柱。當(dāng)然這些比較經(jīng)典的方法對于很多極性化合物的分析效果都是不錯的,但是都會面臨一些問題。

 

比如,加入離子對試劑,本身離子對試劑對于色譜柱的壽命會有一定的影響,流動相制備也相對復(fù)雜,另外很多時候也沒法與質(zhì)譜兼容;采用極性封端類的柱子,流動相中會用到比較高比例的水,壓力會比較高,而且即使水相比例較高,對于一些很強極性的物質(zhì),仍然難以得到很好地保留。而HILIC可以克服以上的缺點,大大滿足您對極性化合物的分析要求。

 

什么是HILIC ?

 

HILIC是 Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography(親水作用液相色譜)的簡稱。我們首先要清楚,HILIC不是某個廠家的色譜柱系列或品牌,也不是某個鍵合相,它代表的是一種分離機理,而具備這種分離機理的鍵合相種類非常多。在HILIC中,固定相是極性的,流動相中的水相部分表現(xiàn)為強洗脫溶劑,這與傳統(tǒng)的反相色譜法*相反。

 

HILIC 發(fā)展歷史

 

HILIC分離模式早可以追溯到1951年,Gregor等人描述了一種離子交換樹脂表面的富水層概念,在1975年的時候,科學(xué)家在氨基柱上實現(xiàn)了糖類的分析也是屬于HILIC的機理,但是直到1990年科學(xué)家Alpert才正式提出了HILIC的概念,但是這時候HILIC并沒有得到廣泛的推廣,到了2000年以后,越來越多的人開始認識并使用HILIC機理進行極性化合物的分析,HILIC才得到了廣泛的認可。

 

HILIC 的作用機理

 

HILIC可以被認為是反相液相色譜通過采用極性固定相來運行的。HILIC中采用的流動相是含有少量水/緩沖鹽或其他極性溶劑的高比例有機相(>60%,常用乙腈)。流動相中的水形成一個富水層被吸附在固定相表面,極性物質(zhì)首先進入富水層得到保留。極性化合物是通過一個復(fù)雜的混合模式被保留的,包括:富水層和流動相之間的親水分配、極性官能團和固定相間的氫鍵作用以及離子官能團的靜電作用。當(dāng)然,親水分配是主要的保留模式。從保留機理來看,HILIC和反相色譜柱是有著非常大的差別的。

 

HILIC 流動相

 

HILIC常用的流動相是乙腈/水系統(tǒng)。比例:有機溶劑>60%,流動相中至少需要3%的水相(因為HILIC保留機理是通過形成富水層來實現(xiàn)的)。洗脫強度:四氫呋喃<丙酮<乙腈<異丙醇<乙醇 <甲醇<水。對于條件摸索來說,等度條件下建議80%乙腈為起始條件來調(diào)整比例;梯度條件建議95%乙腈------60%乙腈。對于HILIC來說,我們有時也會在流動相中加入緩沖鹽,建議使用甲酸銨/乙酸銨(常用乙酸銨)緩沖液,可以同時滿足溶解度(醋酸鹽在高比例乙腈中溶解度較好)以及質(zhì)譜檢測器兼容性的要求。

 

HILIC 固定相

 

上面我們提到,HILIC保留機理的固定相種類非常多。常用的包括:

1,裸硅膠(如賽默飛的Hypersil Silica, SyncronisSilica及Accucore HILIC等),這種固定相在HILIC中也是應(yīng)用廣泛的固定相,未鍵合硅膠由于表面具有硅羥基,具有一定的陽離子交換活性,所以可以增強對堿性化合物的保留。

 

2,兩性離子固定相(如Syncronis HILIC),此種固定相既有陽離子基團,又有陰離子基團,二者比例1:1,因此表面靜電荷為零。對于分析中性極性化合物是一個不錯的選擇。

 

3,酰胺鍵合相(如Accocore Amide HILIC),通過丙基或者專有連接基團將酰胺官能團鍵合到硅膠表面,此種鍵合相能夠提供固定相和分析物之間的強有力的氫鍵作用,保留能力強,對于碳水化合物分析是一個不錯的選擇,如聚糖的分析。酰胺鍵合相不太容易產(chǎn)生不可逆吸附(氨丙基固定相經(jīng)常會遇到這樣的問題),同時酰胺類色譜柱表現(xiàn)出良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。其他的HILIC固定相包括:二醇基、氨丙基(氨基柱)、氰丙基(氰基柱)以及其他專有的特殊官能團鍵合相。

 

HILIC 的優(yōu)勢及不足

 

通過上面我們介紹到的HILIC的機理及流動相和固定相的特征我們不難得出HILIC在分析極性化合物方面的優(yōu)勢。首先,HILIC機理對于幾乎所有的極性化合物都有較好的保留,大大解決了我們分析極性化合物時遇到的難以保留的問題。其次,由于HILIC流動相有機相比例很高,所以對于質(zhì)譜檢測器來說,可以確保去溶劑化,大大提高化合物的信噪比。另外,較高的有機相比例組成也會帶來更低的色譜柱壓力,在這個基礎(chǔ)上,我們采用小粒徑或者小內(nèi)經(jīng)的色譜柱時就不會受到壓力的困擾。

 

HILIC的優(yōu)勢是很明顯的,但是對于任何一種分離手段,也都存在一些不足之處。由于HILIC保留機理比較復(fù)雜,所以在方法優(yōu)化及色譜柱選擇上會比普通反相色譜柱要復(fù)雜。HILIC保留機理由于需要形成富水層,所以色譜柱平衡時間會稍長,建議是普通反相的2-3倍,當(dāng)然,這個問題其實在反相采用離子對試劑分析的時候也會碰到。另外,由于極性化合物在水中的溶解性好,但是如果我們采用純水相來溶劑樣品的話,有時候會出現(xiàn)溶劑效應(yīng)帶來的色譜峰展寬,就如同我們反相分析時用純有機相溶解樣品有時也會出現(xiàn)類似的問題。所以,建議采用純有機相或者與流動相比例接近的溶劑來溶解樣品。

 

通過以上關(guān)于HILIC的介紹,相信大家對HILIC有了更進一步的了解。在以后我們分析極性化合物方面又多了一個更有力的工具!

 

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